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新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

??解決血清使用中的常見(jiàn)問(wèn)題

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

1、 如何儲(chǔ)存和解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損？

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。因此，推薦在-20℃以下儲(chǔ)存血清，并避免反復(fù)凍融。

我們建議血清應(yīng)保存在-2O℃。若存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶，建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

2、血清中包含絮狀沉淀，它們是什么，怎么處理？

沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性，不會(huì)影響產(chǎn)品性質(zhì)。要除去沉淀，離心血清（400g，1-2分鐘）或者簡(jiǎn)單的讓其沉淀在瓶子底部，將血清小心的轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)菌瓶里（一般不建議采用過(guò)濾的方法除去沉淀，因?yàn)槌恋頃?huì)堵塞濾膜而無(wú)法過(guò)濾）。大多情況輕輕搖動(dòng)沉淀并加熱至37℃就會(huì)再溶解。所以，使用產(chǎn)品時(shí)要搖動(dòng)并加熱血清至37℃，沉淀會(huì)自然消失。

3、實(shí)驗(yàn)室如何選擇適合的血清？

國(guó)內(nèi)一致認(rèn)為HYCLONE的血清是最好的，但是根據(jù)我在北美的經(jīng)歷，國(guó)外一般認(rèn)為GIBCO比HYCLONE好，所以并不是價(jià)格決定質(zhì)量，但是總的來(lái)說(shuō)這兩種價(jià)格普遍偏貴，一般不是太嬌氣的細(xì)胞，國(guó)產(chǎn)的就夠用了 。此外，由于國(guó)內(nèi)HYCLONE，GIBCO并沒(méi)有生產(chǎn)線，我們只能從代理商那里買，而代理商又魚(yú)龍混雜，所以買到假貨的可能性也很大。所以，我一般會(huì)從直銷員那里買血清，有的國(guó)外生物公司由于剛剛進(jìn)入中國(guó)，知名度不高，但是其實(shí)在 國(guó)外已經(jīng)做得很不錯(cuò)了，如Wisent等，他們?cè)趪?guó)內(nèi)有辦事處，我會(huì)從那里拿，血清的品質(zhì)和HYCLONE不相上下，但價(jià)格相對(duì)優(yōu)惠很多。

4、 如何避免血清中產(chǎn)生沉淀？

按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生：

（1）解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

（2） 血清分裝凍存時(shí)，須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一。

（3） 勿直接由-20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

（4） 勿將血清置于37℃太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成份也會(huì)因此受到破壞，從而影響血清的品質(zhì)。

（5） 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

（6） 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

5、 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。

新西蘭血源胎牛血清解凍和滅火

6、 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

7、 有必要做熱滅活嗎?

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒(méi)有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量!

8、細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點(diǎn)是污染嗎？如何處理？

一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒(méi)有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：

（1）細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)老，破碎的細(xì)胞殘骸；

（2）血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果；

（3）配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長(zhǎng)；

（4）配制培養(yǎng)基的水質(zhì)、容器不合格?？蓱?yīng)用離心、過(guò)濾的方法去除這些黑點(diǎn)；

（5）培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

9、 細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止黑點(diǎn)生成？

（1） 盡可能地減少血清凍融次數(shù)。

（2） 培養(yǎng)基無(wú)需37℃水浴。

（3） 培養(yǎng)基保持最佳PH值7.0- 7.2。

（4） 嚴(yán)格控制配制培養(yǎng)基的水質(zhì)，容器定期刷洗。

（5） 掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，細(xì)胞切勿生長(zhǎng)過(guò)老。

1、 化凍

將血清從-20度冰箱中取出，室溫（或浸于自來(lái)水中）化凍（約需要30分鐘至2小時(shí)，也可放于4度冰箱化凍過(guò)夜；化凍后若不馬上滅活，可以放入4度冰箱中暫時(shí)保存）

2、滅活

（1）放入室溫的水浴鍋內(nèi)開(kāi)始加熱（同時(shí)放入一個(gè)空的血清瓶，內(nèi)裝100ml自來(lái)水，插入一根溫度計(jì)，溫度監(jiān)控以此為準(zhǔn)）

（2）當(dāng)溫度計(jì)顯示56度時(shí)，停止加熱，改為間斷加熱，維持56度（±0.5度）30分鐘（±3分鐘；若不小心使溫度上升超過(guò)56度，則：若仍未超過(guò)60度，且時(shí)間很短，比如不超過(guò)5分鐘，則仍可使用；若超過(guò)60度，或者時(shí)間較長(zhǎng)，則棄去不用，或者嘗試用于一些普通細(xì)胞的培養(yǎng)）

（3）取出，自然冷卻至室溫（約需1-3小時(shí)），可分裝或-20度繼續(xù)凍存。

3、分裝

（1）轉(zhuǎn)入無(wú)菌間，在超凈臺(tái)內(nèi)將血清分裝入10ml離心管中（注意預(yù)先要將血清輕輕搖動(dòng)數(shù)周、混勻；用吸液管或吹大管吹出血清時(shí)要注意：不要吹出氣泡（血清很粘稠，很容易產(chǎn)生氣泡；如果產(chǎn)生氣泡，則在酒精燈火焰上過(guò)一下））

（2）放入-20度冰箱凍存

（3）全部操作約需要4-6小時(shí)

查了點(diǎn)資料，我認(rèn)為胎牛血清是不用滅滅活的。

滅活針對(duì)的是補(bǔ)體，補(bǔ)體系統(tǒng)的各成分，以無(wú)活性的前體存在于血漿中。需要時(shí)，再在激活物如抗原—抗體復(fù)合物等的作用下，依次被激活。

那么胎牛在離開(kāi)母體前是接觸不到可以做激活物的抗原的，血清里的補(bǔ)體是無(wú)活性的，所以就不用滅活的了。推之，小牛血清需要滅活。

不同看法，argue一下：

補(bǔ)體可以通過(guò)替代途徑參與免疫反應(yīng)，無(wú)免疫球蛋白不代表補(bǔ)體沒(méi)有作用。 是否需要滅活主要決定于細(xì)胞培養(yǎng)體系能否激活補(bǔ)體。如果要加入一些損傷明顯的因子，破壞細(xì)胞膜，暴露了糖脂，可以激活補(bǔ)體的。這種情況下的血清要求滅活。

小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別與注意事項(xiàng)

來(lái)源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過(guò)心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。 組份與比例不同：兩者所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長(zhǎng)，而有些細(xì)胞只需小牛血清即可，使用濃度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意：血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超過(guò)一個(gè)月。解凍血清時(shí) ，應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱，并經(jīng)常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，絕對(duì)不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中，如放在37℃解凍，顏色加深，粘稠度也會(huì)增加，血清在解凍和熱滅活后，應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。????

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